产品描述
《Quick Cell PCR法支原体检测试剂盒》是一种广谱的支原体检测试剂盒,根据支原体DNA序列,本试剂盒可以识别所有100多种至今已发现的支原体。可用于检测所有可能含支原体的样品,比如:(1)体外细胞培养的上清;(2)血清;(3)各种体液,如唾液、尿液、鼻腔分泌物等;(4)其他液体样品。
试剂盒组成
(1) 支原体引物和内参(100次):200 μL
(2) 阳性支原体DNA:50 μL
? 注意1:本试剂盒提供的支原体引物和内参可供至少100次支原体检测使用。
2:以下试剂需要自己准备:(1)灭菌的去离子水;(2)普通的Taq DNA 聚合酶和相应的缓冲液;(3)2.5 mM的dNTP;(4)6× DNA上样缓冲液。
使用方法
1、待测样品的准备
为了准确判断细胞是否有支原体的污染,待测的细胞培养液样品最好来源于至少培养3天且汇合度在70-90%左右的细胞培养液上清(贴壁细胞)。悬浮培养的细胞也需要在换液传代后,至少让细胞生长3天再取培养液进行检测。取150 μL上述待测样品,在普通台式离心机上1200 rpm (大约150-200 g)离心5 min,取离心后的上清100 μL用于支原体检测,丢弃下层剩余的50 μL(含细胞沉淀)。收集并已经离心去除细胞的待测样品如果不立即检测,请放于-20℃或-80℃冰箱保存,不得放于室温或4℃冰箱。样品在-20℃至少可以保存一个月,在-80℃基本可以长期保存。
注意:本步骤的低速离心是为了去除哺乳动物细胞,以排除其不必要的干扰。所以离心力要严格控制在150-200 g,该离心力下,哺乳动物细胞将被沉淀下来而支原体不会。如果错误使用更高的离心力将可能导致支原体也被离心下来,从而导致假阴性。
2、PCR体系的配制。请按下表进行PCR体系(总体积25 μL)配制:
实验体系
Negative Control
Positive Control
Sample
去离子水
17.5 μL
15.5 μL
15.5 μL
10×Taq DNA 聚合酶缓冲液(含Mg2+)
2.5 μL
2.5 μL
2.5 μL
2.5 mM dNTP
2.5 μL
2.5 μL
2.5 μL
5 Units/μL Taq DNA 聚合酶
0.5 μL
0.5 μL
0.5 μL
支原体引物和内参
2 μL
2 μL
2 μL
阳性支原体DNA
-
2 μL
-
待测样品
-
-
2 μL
3、PCR设置参数
1 cycle
94 ℃ for 2 minutes
35 cylses
94 ℃ for 20 seconds
55 ℃ for 20 seconds
72 ℃ for 45 seconds
1 cycle
72 ℃ for 5 minutes
1 cycle
8 ℃ for ∞
4、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
(1) 配制1.5% DNA琼脂糖凝胶。安全起见,建议选用李记生物的GelRe的核酸染料。
(2) 往每个PCR管内加入5 μL 6× DNA上样缓冲液。
(3) 取上述含DNA上样缓冲液的PCR产物10 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。
(4) 当溴酚蓝染料跑出3厘米左右时,停止电泳,拍照。
结果判断
PCR扩增的结果有可能出现以下几种情况:
电泳结果
电泳结果
电泳结果
电泳结果
电泳结果
电泳结果
586 bp内参条带
++
-
+
++
++
-
270 bp左右条带
-
++++
+++
++
+
-
结果图示(见图1)
泳道1
泳道2
泳道3
泳道4
泳道5
泳道6
支原体污染判断
阴性
极重度污染
重度污染
中度污染
轻度污染
PCR被抑制
注:“-”代表没有条带;“+”代表有条带;“+”号越多代表条带越强。
图1. 支原体PCR扩增结果。586 bp条带为内参条带,270 bp左右的条带为支原体特异条带(各支原体的条带大小会略有不同,总体在260-280 bp)。随着支原体DNA模板的增加,270 bp左右的条带会逐渐增强而586 bp的内参条带会逐渐减弱,甚至消失。泳道1:阴性对照或者没有支原体污染的样品;泳道2:极重度支原体污染样品;泳道3:重度污染样品;泳道4:中度污染样品;泳道5:轻度污染样品;泳道6:PCR的扩增被细胞的代谢产物抑制,导致扩增失败。M:DNA marker.
注意事项
1、每次检测都应该设有阴性对照,作用有:(1)阴性对照会有一条586 bp的内参条带,这样可以验证本试剂盒含有的支原体引物和内参以及自己准备的Taq DNA 聚合酶,dNTP等试剂没有问题;(2)只有当阴性对照的结果没有出现270 bp左右的支原体特异条带时,别的样品的结果才是可信的。
2、如果586 bp条带和270 bp左右的条带都没有出现(如图1,泳道6),在排除PCR试剂的问题后(即阴性对照可以正常扩增),说明该样品含有抑制PCR扩增的代谢产物。有关PCR的扩增会被细胞的代谢产物抑制的问题,Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit(货号MP0035)的PCR法支原体检测试剂盒说明书中也特别提到了这点,说明这是一个PCR法支原体检测中经常遇到的问题,其强烈建议用试剂盒进行DNA提取后再进行鉴定。这也是PCR法支原体检测的致命弱点。为了克服该问题,以下问题必须注意:(1)您购买的PCR法支原体检测试剂盒,其扩增产物中必须含有内参(Internal Contol)条带作为对照【本试剂盒的586 bp条带就是内参条带】。否则,如果没有内参作为对照,即使样品扩增后没有支原体特异条带,你也无法确定是因为样品确实没有支原体还是因为PCR被细胞的代谢产物抑制导致的假阴性。(2)如果出现PCR的扩增被细胞的代谢产物抑制时,请使用血液基因组DNA抽提试剂盒,抽提支原体DNA后再进行PCR鉴定。(3)同时使用本公司生产的《Quick Cell支原体快速检测试剂盒》进行检测,经严格测试,该试剂盒的扩增不会被细胞的代谢产物抑制。
3、根据支原体DNA的序列,本试剂盒可以识别所有100多种至今已发现的支原体,具有广谱的识别能力。
4、如发现细胞被支原体污染,本公司提供细胞专用支原体清除和预防试剂。
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保存
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